REFLEXIONES INICIALES.
Defina los siguientes términos:
Absorbancia.
Es cuando un haz de luz incide sobre un cuerpo traslucido y una parte de esta luz se absorbe por el cuerpo y la otra parte atraviesa dicho cuerpo. Cuando hay una mayor cantidad de luz absorbida se dice que mayor es la absorbancia del cuerpo, por consiguiente, la cantidad que trasmita dicho cuerpo es menor. La absorbancia a una determinada longitud de onda lambda, se define de la siguiente manera:
Donde I es la intensidad de la luz que pasa por la muestra (luz transmitida) y I0 es la intensidad de la luz incidente. (Gonzalez, 2010)
Densidad óptica.
Es la observancia por unidad de longitud que recorre la luz al atravesar la sustancia y se obtiene a partir de la ecuación, como sigue:
Donde corresponde al espesor de la muestra. (Medición de la observancia óptica de soluciones acuosas mediante la instrumentación virtual y el control, 2014)
Transmitancia porcentual.
La transmitancia porcentual o el porcentaje de transmitancia se representa de la siguiente manera y se expresa por la siguiente ecuación: (Manual de mantenimiento para equipo de laboratorio)
Absortividad.
Es la cantidad de luz que está es capaz de absorber. Es la relación entre su absorbancia y la concentración de la solución por la longitud de la celda en la cual se halla dicha solución, ya que está es la trayectoria que la luz debe atravesar.
La absortividad es directamente proporcional a la conductividad del soluto presente en la solución absorbente. (Gonzalez, Absortividad, 2010)
Absortividad molar.
Es una propiedad química que indica cuanta luz puede absorber una especie en solución. Este concepto es muy importante dentro de los análisis espectroscópicos de absorción de radiación de fotones con energías en el rango de ultravioleta y visible (UV-VIS). (Bolivar)
Extinción y Coeficiente de extinción molar.
Está constante está representada por la variable ɛ también es llamada coeficiente de absorción molar, absortividad molar o coeficiente de extinción . Es la característica de una sustancia que nos dice cuanta luz absorbe a una longitud de onda determinada.
Este es un componente esencial de la ley Beer-Lambert, el cual se representa con la siguiente ecuación:
En donde:
· Abs = absorbancia.
· K = coeficiente de extinción molar.
· C = Concentración.
· L = Distancia que viaja la luz a través de la muestra (normalmente es de 1 cm)
El coeficiente de extinción se determina realizando una serie de diluciones de la sustancia de interés. Luego se mide la absorbancia de cada muestra de dilación a un largo de onda determinado. (Patlan Velazquez , 2015)
Espectro de absorción.
Se conoce como espectro de absorción al gráfico de la cantidad de radiación absorbida respecto a la longitud de onda para un compuesto particular. El espectro de absorción normalizado es característico para cada compuesto particular, no cambia con la concentración por tanto se considera como la “huella digital” química del compuesto. (Perez)
Curva estándar.
La curva estándar son gráficos que muestran la respuesta de un método analítico en función de cantidades conocidas de concentraciones. En las curvas estándar es importante conocer la absorbancia, que es la relación logarítmica entre la intensidad de la luz que incide sobre una muestra y la intensidad de esa misma luz que es trasmitida a través de la muestra. (Gutierrez Alvarez, 2015)
¿Cuál es la diferencia fundamental entre un espectrofotómetro convencional y un colorímetro o fotocolorímetro?
Estos son equipos los cuales son usados para el análisis de muestra fisiológicas, los cuales se basan en el principio que cada compuesto químico puede absorber o emitir energía lumínica de diferente longitud de onda.
El fotómetro o fotocolorímetro trabaja únicamente en el espectro de luz visible y selecciona una longitud de onda determinada mediante filtros fijos. Un espectrofotómetro es capaz de trabajar no solo con la luz visible, sino que en otras regiones del espectro electromagnético (ultravioleta e infrarroja) además posee un monocromador para seleccionar la longitud de onda deseada. (Colorimetro y espectrofotómetro)
¿Cuál o cuáles son las diferencias entre un espectrofotómetro convencional y uno de arreglo de diodos o fotodiodos?
En unes espectrofotómetro convención de un solo haz, el blanco y la muestra se miden de manera consecutiva, con un intervalo que va desde varios segundos para lecturas con una sola onda de longitud de onda hasta varios minutos para lecturas de todo el espectro. Las desviaciones de la lampara pueden resultar en errores significativos durante largos intervalos de tiempo. (Espectroftometro convencional o haz simple)
Ilustración 1 Espectrofotómetro de haz simple o convencional
El espectrofotómetro de arreglo de diodos utiliza una óptica invertida, esto quiere decir que tola la luz de la fuente atraviesa la muestra y luego es dispersada en un monocromador.
Ilustración 2 Espectrofotómetro de arreglo de diodos.
¿Qué tipo de detectores se utilizan en fotocolorímetros y espectrofotómetros?
Existen tres montajes fotoeléctricos que se emplean para la detección de la radiación:
1. Células fotovoltaicas o de barrera.
2. Fototubos.
3. Células fotoconductivas.
¿Cómo funcionan estos detectores?
Las células fotovoltaicas o de barrera la energía radiante genera una corriente en la interfase de un semiconductor y un metal.
Ilustración 3 Esquema representativo de una célula fotovoltaica o de barrera
Los fototubos son en los que la radiación origina la fotoemisión de electrones desde una superficie sólida.
Ilustración 4 sistema detector constituido por un fototubo.
Las células fotoconductivas, son en las que la absorción de la radiación por un semiconductor origina un cambio en su resistencia eléctrica. Se emplean especialmente para detectar la radiación infrarroja (750 – 3500nm).
Actividad experimental.
MARCO TEÓRICO.
La espectrofotometría es una técnica que forma parte de la química analítica la cual nos permite determinar cuál es la concentración de un compuesto en un solución específica, está tiene como base la cantidad de radiaciones electromagnéticas que son absorbidas por las moléculas y la cual depende de forma lineal de la cantidad de concentración.
OBJETIVO.
Está práctica tiene como objetivo entender el funcionamiento de un espectrofotómetro y realizar una curva estándar.
MATERIALES.
Para la realización de esta práctica es necesario usar diversos simuladores con la finalidad de poder realizar dicha práctica de manera virtual.
DESARROLLO O PROCEDIMIENTO.
Práctica 1. Simulador de espectros de absorción ultravioleta de proteínas y ácidos nucleicos.
Procedimiento:
a) Seleccionar Marcar longitudes de onda características.
b) seleccionar Superponer curva.
c) Seleccionar para cada uno de los ejemplos un color diferente.
a) Realiza una tabla con los valores de A (Absorbancia para cada una de las muestras de los ejemplos
e) realiza una impresión de pantalla.
Práctica 2. Ensayo colorimétrico de actividad enzimática.
La muestra contiene la enzima que queremos determinar: 6-O-α-L-ramnosil- D glucosidasa, EC 3.2.1.168, de Actinoplanes missouriensis
1. Desplaza los controles para elegir un pH y una temperatura para el ensayo.
2. Ve pulsando los botones para añadir los componentes de la reacción a la cubeta del ensayo.
3. El botón “añadir sustrato” vaciará antes la cubeta. El botón “añadir muestra” iniciará la incubación.
4. Una vez se haya desarrollado el color, pulsa el botón para medir la absorbancia y anota su valor.
5. Modifica de forma sistemática el pH o la temperatura y anota cada valor de absorbancia.
Práctica 3. Simulador de espectros de dicroísmo circular de proteína.
Procedimiento:
a) Seleccionar ✅ superponer curvas.
b) Seleccionar para cada uno de los ejemplos un color diferente.
c) Introduce los porcentajes de cada tipo de estructura secundaria, o elige entre los 8 ejemplos.
d) Realiza una impresión de pantalla.
¨Simulador de espectros de absorción ultravioleta de proteínas y ácidos nucleicos¨ http://biomodel.uah.es/lab/abs/uvProtDNA.htm
| Ejemplo | Contiene | | | | | Color | |
| DNA % | PROT % | ||||||
| Solo proteína | 0 | 100 | 100,0 | 0.312 | 0.459 | 0.68 | Celeste |
| Solo DNA | 100 | 0 | 0,100 | 0.591 | 0.328 | 1.80 | Rojo |
| Muestra 1 | 22 | 78 | 78,22 | 0.374 | 0.430 | 0.87 | Rosa |
| Muestra 2 | 64 | 36 | 36,64 | 0.491 | 0.375 | 1.31 | Verde |
| Muestra 3 | 48 | 52 | 52,48 | 0.446 | 0.396 | 1.13 | Amarillo |
| Muestra 4 | 90 | 10 | 10,90 | 0.563 | 0.341 | 1.65 | Naranja |
Ensayo colorimétrico de actividad enzimática http://biomodel.uah.es/lab/abs/activ_enz.htm
En la primera tabla se mostrarán diversos pH y temperatura diferente.
| pH | T (°C) | |
| 3 | 30 | 0.003 |
| 4 | 35 | 0.003 |
| 5 | 40 | 0.005 |
| 6 | 45 | 0.054 |
| 7 | 50 | 0.164 |
| 8 | 55 | 0.587 |
| 9 | 60 | 1.588 |
| 10 | 65 | 0.033 |
| 11 | 70 | 0.058 |
En esta segunda tabla se mostrará el mismo pH a diferente temperatura, con la finalidad de observar el cambio de observancia de un pH a diferentes temperaturas.
| pH | T (°C) | |
| 7 | 30 | 0.035 |
| 7 | 35 | 0.034 |
| 7 | 40 | 0.032 |
| 7 | 45 | 0.096 |
| 7 | 50 | 0.164 |
| 7 | 55 | 0.392 |
| 7 | 60 | 0.567 |
| 7 | 65 | 0.730 |
| 7 | 70 | 0.817 |
| 7 | 75 | 0.781 |
| 7 | 80 | 0.639 |
Simulador de espectros de dicroísmo circular de proteínas http://biomodel.uah.es/lab/dc/inicio.htm
| Ejemplo | Porcentaje de estructura secundaria | | Color | |||
| Alfa | Beta | Giro | Aleatoria | |||
| Solo alfa | 100 | 0 | 0 | 0 | (100,0,0,0) | Azul fuerte |
| Solo beta | 0 | 100 | 0 | 0 | (0,100,0,0) | Azul celeste |
| Solo giro | 0 | 0 | 100 | 0 | (0,0,100,0) | Rojo |
| Solo aleatoria | 0 | 0 | 0 | 100 | (0,0,0,100) | Morado |
| Mioglobina | 78 | 0 | 12 | 10 | (78,0,12,10) | Rosa |
| Lisozima | 36 | 9 | 32 | 23 | (36,9,32,23) | Verde |
| Triosa-fosfato-isomerasa | 52 | 14 | 11 | 23 | (52,14,11,23) | Negro |
| Quimotripsina | 10 | 34 | 20 | 36 | (10,34,20,36) | Naranja |
Resultados y discusión.
Práctica 1.
El uso de la espectrofotometría en masas de proteína nos permite identificar la cuantificación de proteínas. Este es un paso importante para poder realizar el análisis proteómico, además de identificar la caracterización proteica, para poder cuantificar una proteína específica. Para ello normalmente son añadidos isótopos estables más pesado de carbono o nitrógeno
a una muestra de proteínas. (Johnson)
Dado que los ácidos nucleicos tienen un máximo de absorción a una longitud de onda de 260nm, la absorción es proporcional a la concentración. El espectrofotómetro permite identificar el coeficiente de extinción molar con la longitud de onda.
Práctica 2.
Se identifica la curva de absorción de la actividad enzimática, que se genera en un pH estable, pero con un incremento de temperatura.
Práctica 3.
En esta práctica se identifica el dicroísmo circular de ciertas proteínas como la lisozima, triosa-fosfato-isomerasa y la quimiotripsina.
El dicroísmo circular se expresa como la propiedad que poseen ciertos materiales de absorber la luz a diferentes grados, dependiendo de la forma de polarización de haz incidente, esto permite identificar el grado de observancia que tiene cierta proteína. (Mata Martínez, 2013)
Ilustración 5 Esquema de dicroísmo circular en el que se mide la diferencia de absorción.
CONCLUSIONES.
El uso del espectrofotómetro es útil para identificar cual es la sustancia que se encuentra en una muestra problema, sin embargo, no es posible determinar de una manera exacta que tipo de compuesto es, para ello es necesario un análisis más detallado.
Este tipo de instrumento juega un papel de vital importancia en laboratorios o industrias.
Referencias
Bilioteca Virtual de Desarrollo Sostenible y Salud Ambiental. (s.f.). Recuperado el 16 de noviembre de 2019, de http://www.bvsde.paho.org/bvsacd/cd29/laboratorio/cap11.pdf
Bolivar, G. (s.f.). Lifeder.com. Recuperado el 16 de noviembre de 2019, de https://www.lifeder.com/absortividad-molar/
Equipos y laboratorios de Colombia. (s.f.). Recuperado el 16 de noviembre de 2019, de https://www.equiposylaboratorio.com/sitio/contenidos_mo.php?it=1027
Gonzalez, M. (8 de noviembre de 2010). La guía. Recuperado el 16 de noviembre de 2019, de Química: https://quimica.laguia2000.com/conceptos-basicos/transmitancia-y-absorbancia
Gonzalez, M. (17 de noviembre de 2010). La guía. Recuperado el 16 de noviembre de 2019, de Química: https://quimica.laguia2000.com/conceptos-basicos/absortividad
Gutierrez Alvarez, E. (3 de septiembre de 2015). Academia. edu. Recuperado el 16 de noviembre de 2019, de https://www.academia.edu/15366924/Curvas_Est%C3%A1ndar_y_Concentraci%C3%B3n
Hanna Instruments. (s.f.). Recuperado el 17 de noviembre de 2019, de https://www.hannacolombia.com/blog/post/206/las-bases-la-espectrofotometria
Johnson, M. (s.f.). Labome. Recuperado el 17 de noviembre de 2019, de http://www.labome.es/method/Protein-Quantitation.html
Mata Martínez, E. (19 de noviembre de 2013). Universidad Autónoma de México. Recuperado el 17 de noviembre de 2019, de Métodods Fisico-Quimicos en Biotecnología: http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/dicroismocircular2013.pdf
Medición de la observancia óptica de soluciones acuosas mediante la instrumentación virtual y el control. (marzo de 2014). Scientia et Technica, 19(1), 49 - 53. Recuperado el 16 de noviembre de 2019, de https://revistas.utp.edu.co/index.php/revistaciencia/article/download/8897/5705
Patlan Velazquez , L. F. (2015). Universidad Autónoma de México. Recuperado el 16 de noviembre de 2019, de Facultad de Química: http://microelectrochemalexbaeza.com/wp-content/uploads/2015/04/Informe-final-t1PATLAN.pdf
Perez, G. (s.f.). Espectrometría. Recuperado el 16 de noviembre de 2019, de https://www.espectrometria.com/espectrometra_de_absorcin
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