Desarrollo.
Actividad 1. Relación entre absorbancia y concentración.
Materiales:
Utilizaremos una disolución de Para-nitrofenol (PnF), que es un compuesto con color amarillo en medio alcalino.
Calibración:
Primeramente, llena una cubeta con 3 mℓ de agua, introdúcela en el espectrofotómetro, ajusta la longitud de onda a 405 nm y pulsa el botón “A=0”. Saca la cubeta y vacíala
Diseño del experimento:
Utilizando el Para-nitrofenol (PnF) y agua, prepara 3 muestras en sendas cubetas, que contengan distintos volúmenes de PnF y siempre un volumen total de 3 mℓ.
Para ayudarte a hacerlo, rellena previamente esta tabla (o mejor, una que hagas en tu cuaderno de laboratorio) con los volúmenes que piensas poner en cada cubeta:
| Cubeta | 1 | 2 | 3 |
| Volumen de PnF | 2 | 1 | 2 |
| Volumen de agua | 1 | 2 | 1 |
Una vez preparadas las 3 mezclas en las 3 cubetas, introdúcelas de una en una al espectrofotómetro y anota sus medidas de absorbancia.
| Cubeta | 1 | 2 | 3 |
| | 1.117 | 0.559 | 1.088 |
Gráfica.
Análisis cualitativo de resultados:
Observa la relación entre el color de las cubetas y el valor de absorbancia. Comparando las 3 medidas, ¿observas alguna dependencia entre el valor de absorbancia y la mayor o menor concentración de PnF en la cubeta?
Análisis cuantitativo de resultados: Calcula la concentración de PnF en la mezcla final de cada cubeta, sabiendo que la concentración en la botella es de 80 μM PnF. Prepara una tabla con los datos y traza una gráfica representando A frente a C. ¿Cómo puedes describir lo que observas?
| Cubeta | mM | A405 |
| 1 | 80 | 1.117 |
| 2 | 80 | 0.559 |
| 3 | 80 | 1.088 |
Observando la gráfica comparativa y el color de cada una de la cubetas podemos ver que el resultado va cambiando de acuerdo con la cantidad de volumen de agua que se agrega a cada cubeta. Así mismo podemos ver cuáles son los resultados que se obtienen en cada una de las cubetas, y que se plasman en la tabla.
Actividad 2. Fundamento de un ensayo de cuantificación de proteínas.
El que se conoce como método de Bradford es un ensayo habitual para medir la concentración de proteínas en una muestra. Se basa en que la unión del colorante azul de Coomassie (Coomassie Brilliant Blue G250) a las proteínas modifica el espectro visible de aquél.
Materiales:
· Reactivo de Bradford, que contiene azul de Coomassie, metanol o isopropanol, y ácido fosfórico
· Proteínas disueltas en el reactivo
Diseño del experimento:
Prepara una cubeta sólo con reactivo de Bradford y otras dos cubetas (o más) con cantidades diferentes de la disolución de proteína. Añade a todas las cubetas la cantidad de reactivo necesaria para un volumen total de 3 mℓ en cada una.
Para ayudarte a hacerlo, rellena previamente esta tabla (o mejor, una que hagas en tu cuaderno de laboratorio) con los volúmenes que piensas poner en cada cubeta:
| 1 | 2 | 3 |
| |
| Volumen de | 2 | 2 | 2 | Proteína ml |
| Volumen de | 1 | 1 | 1 | Reactivo ml |
Calibración:
Introduce la primera cubeta (que sólo contiene el reactivo de Bradford) en el espectrofotómetro, ajusta la longitud de onda a 595 nm y pulsa el botón “A=0”. Esta muestra se denomina el "tubo blanco" o "blanco de reactivos" y sirve para que el color propio del reactivo no se considere en la determinación de proteínas.
Medida:
A continuación, introduce el resto de las cubetas, de una en una, en el espectrofotómetro y anota sus medidas de absorbancia.
| Cubeta | 1 | 2 | 3 |
| A595 | 0.354 | 0.177 | 0.373 |
Análisis cualitativo de resultados:
Observa la relación entre el color de las cubetas y el valor de absorbancia. Comparando entre sí las medidas, ¿observas alguna dependencia entre la absorbancia y la mayor o menor concentración de proteínas en la cubeta?
| Cubeta | C | |
| Blanco | 800 | 0.000 |
| 1 | 800 | 0.354 |
| 2 | 800 | 0.177 |
| 3 | 800 | 0.373 |
Al observar la gráfica se puede uno percatar de que los resultados obtenidos varían poco por consiguiente podemos deducir que dichas muestras son estables.
Actividad 3. Espectro de absorción de la hemoglobina
El color rojo de la hemoglobina se debe a que absorbe radiación visible, aunque también presenta picos de absorción en y cerca de la región ultravioleta.
Diseño del experimento:
Utilizando agua y la disolución de hemoglobina, prepara distintas diluciones y analiza su espectro UV-VIS completo. Para ello, llena una cubeta con hemoglobina y en las otras dos cubetas prepara sendas mezclas diferentes de hemoglobina con agua. Todas las cubetas deben tener un volumen total de 3 mℓ.
Para ayudarte a hacerlo, rellena previamente esta tabla (o mejor, una que hagas en tu cuaderno de laboratorio) con los volúmenes que piensas poner en cada cubeta:
| Cubeta | 1 | 2 | 3 | |
| Volumen de | 3 | 2 | 1 | Hemoglobina ml |
| Volumen de | 0 | 1 | 2 | agua ml |
Medida:
A continuación, introduce al espectrofotómetro las cubetas, de una en una, y pulsa el botón para registrar el espectro entre 200 y 800 nm. Pulsa en el icono de cámara de fotos y copia la imagen resultante para poderlas comparar todas al terminar el experimento.
Análisis cualitativo de resultados:
Compara los 3 espectros. ¿Qué efecto se observa al diluir la hemoglobina de partida? ¿Cambia la posición (λ) de los picos de absorción máxima? Describe lo que observas.
2ª medida:
Observando el espectro, anota dos longitudes de onda (de la región visible, no ultravioleta) en las que haya un pico (un máximo local de absorción). A continuación, mide y anota la absorbancia de las 3 cubetas a cada una de esas dos longitudes de onda. Representa tus resultados en una gráfica, considerando que la concentración de partida de hemoglobina (en la botella) es de 200 mg/ℓ.
| | |
| | | | |
| 1 | 200 | 0.001 | 1.5 |
| 2 | 200 | 0.093 | 1.0 |
| 3 | 200 | 0.91 | 0.005 |
Observando la gráfica podemos ver que con el se registra un incremento según el contenido de cada cubeta, pero con el
se muestra un descenso según el contenido de cada cubeta.
Como nota adicional, se debe de recalcar que todos los desechos de esta práctica deben de ser vertimos en contenedores exclusivos, según sea la sustancia, acida o alcalina.
Conclusiones.
En esta práctica de laboratorio se ha aprendido a identificar las enzimas y el comportamiento que tienen las mismas según el espectrofotómetro. Todos estos conocimientos que se han adquirido serán de extremada utilidad para los ingenieros en bioquímica dado que las enzimas actúan en los seres vivos.
Referencias
Bolivar, G. (s.f.). Lifeder.com. Recuperado el 16 de noviembre de 2019, de https://www.lifeder.com/absortividad-molar/
Gonzalez, M. (17 de noviembre de 2010). La guía. Recuperado el 16 de noviembre de 2019, de Química: https://quimica.laguia2000.com/conceptos-basicos/absortividad
Gonzalez, M. (8 de noviembre de 2010). La guía. Recuperado el 16 de noviembre de 2019, de Química: https://quimica.laguia2000.com/conceptos-basicos/transmitancia-y-absorbancia
López Sanchez, J. L., & Arenas Sosa, I. (junio de 2004). Universidad Autónoma de México. Recuperado el 16 de noviembre de 2019, de Instituto de Biotecnología: http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/espectrometria_de_absorcion.pdf
Sturn, J. C. (2012). U-Cursos. Recuperado el 25 de noviembre de 2019, de https://www.u-cursos.cl/usuario/2775c7595e300ed228a801eb8341e457/mi_blog/r/Espectrofotometria__Uv___Visible2012.pdf
